打開Cas9 更好地控制CRISPR基因編輯

CRISPR-Cas9是一個(gè)革命性的工具，部分原因是它的多功能性：一種由細(xì)菌產(chǎn)生的咀嚼病毒，它還能在人類細(xì)胞中有效地執(zhí)行各種遺傳技術(shù)，包括切割和粘貼DNA、進(jìn)行精確的突變以及激活或失活基因。

加州大學(xué)伯克利分校的研究人員現(xiàn)在通過提供一個(gè)“開”開關(guān)使它更加通用，允許用戶在除指定目標(biāo)之外的所有細(xì)胞中保持Cas9基因編輯器關(guān)閉。

重新設(shè)計(jì)的Cas9酶——研究人員稱之為procas9含有一定長度的蛋白質(zhì)，需要在酶結(jié)合并切割DNA之前進(jìn)行切割。如果科學(xué)家插入一小塊蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)只能被特定的酶切割，例如癌細(xì)胞或傳染性病毒或細(xì)菌的特殊酶，那么這種酶將成為打開Cas9的觸發(fā)器。

ProCas9基本上“感知”其所在的細(xì)胞類型，這是基于蛋白質(zhì)裂解酶(一種所謂的蛋白酶)的存在。

加州大學(xué)伯克利分校分子細(xì)胞生物學(xué)副教授大衛(wèi)薩維奇說：“這是一個(gè)額外的安全層，可以放在分子上，以確保精確切割。”

除了可編程輸出，它還給出了Cas9蛋白的可編程輸入。

薩維奇說：“有許多蛋白酶調(diào)節(jié)細(xì)胞中的信號通路，將正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞，并參與病原體感染?！叭绻覀兡芨兄竭@些信號，我們就能利用這些重要的方式，做出相應(yīng)的反應(yīng)?！?

在這項(xiàng)研究中，Savage和他的同事通過使Cas9對植物和人類病毒如西尼羅河病毒敏感，證明了Cas9的蛋白酶控制。未來，他們相信這項(xiàng)技術(shù)可以用于將CRISPR-Cas9細(xì)菌免疫系統(tǒng)引入植物，幫助它們抵抗有害的病毒病原體。

來自加州大學(xué)伯克利分校和舊金山格拉德斯通研究所的研究人員的這項(xiàng)研究將于1月10日在線發(fā)表在《細(xì)胞》雜志上。

剝?nèi)as9的必需品

Savage最初的研究目標(biāo)是通過切斷DNA來削減Cas9蛋白——實(shí)際上是基因編輯的“剪刀”——最簡單的部分，以獲得最強(qiáng)大的基因編輯器。越簡單，越容易使用和運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞。

他說：“我們知道Cas蛋白是復(fù)雜的，它們具有各種調(diào)節(jié)功能，這對于它們在細(xì)菌免疫系統(tǒng)中的功能非常重要?！拔覀児ぷ鞯闹饕繕?biāo)是馴服它們供人類使用，并去除與基因組編輯無關(guān)的不必要的東西?！?

特別是，他想重新設(shè)計(jì)Cas9，使其更容易附著其他蛋白質(zhì)。這將允許Cas9攜帶具有多種功能的蛋白質(zhì)到DNA的正確位置。這些被稱為融合蛋白，它們有前途的變體可以改變基因表達(dá)，或者在稱為堿基編輯的技術(shù)的情況下，精確地改變脫氧核糖核酸中的堿基或核苷酸。

他用來重新設(shè)計(jì)Cas9的技術(shù)被稱為圓形排列，他從未嘗試過像Cas9這樣復(fù)雜的蛋白質(zhì)。環(huán)形排列包括獲得Cas9蛋白的氨基酸串并切割它，切換兩個(gè)片段的順序，然后允許它折疊成新的3D構(gòu)型。他這樣做是為了把蛋白質(zhì)分成兩部分。

雖然你可能認(rèn)為這將徹底破壞蛋白質(zhì)，但在大約10%的情況下，New protein仍然有效，就像他只是以不同的方式重新排列了蛋白質(zhì)的亞基，而不影響它們的功能一樣。這可能是有效的，因?yàn)檎鏑RISPR-Cas9的發(fā)明者Jennifer Doudna和她的同事們所展示的，Cas9蛋白復(fù)合物具有高度的靈活性，當(dāng)它抓住引導(dǎo)RNA時(shí)，就會移動，與dna結(jié)合，移動到切割DNA鏈的位置。

薩維奇目前正在探索一些Cas9重排，這可能為融合蛋白提供更好的支架，使它們更接近目標(biāo)DNA鏈。

在重新排列Cas9支架的過程中，他偶然發(fā)現(xiàn)自己以不同的方式重新連接了兩個(gè)蛋白質(zhì)片段。

他說：“當(dāng)我們切割蛋白質(zhì)并將舊片段移動到蛋白質(zhì)中的新位置時(shí)，系統(tǒng)對兩個(gè)片段連接在一起的方式變得非常敏感?！拔覀円庾R到，我們可以利用這種敏感性來設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)，以獲得蛋白酶識別位點(diǎn)。”

他說，研究表明“我們不堅(jiān)持蛋白質(zhì)，這是大自然賦予我們的基因組編輯器”?！斑@些蛋白質(zhì)可以經(jīng)過精心優(yōu)化，成為自然界中沒有的支架，但它們具有適合人類細(xì)胞的特性。”

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