這篇文章是給那些想知道“我怎么知道我的細菌培養(yǎng)什么時候‘結(jié)束’的人看的？”什么時候可以收獲細胞？
細菌生長曲線概述
讓我們回顧一下細菌生長曲線的四個基本階段：log階段、滯后階段、靜止階段和死亡階段(圖1)。在此期間，細胞正在適應和調(diào)整自己的新環(huán)境。然后，培養(yǎng)物進入對數(shù)期，在此期間細胞迅速分裂，數(shù)量翻倍(在對數(shù)期大腸桿菌每20分鐘翻倍)。當您在液體培養(yǎng)基中達到最大細胞密度時，細胞進入靜止期。在這個階段，細胞數(shù)量整體上沒有增加。33，354個死亡細胞被新分裂的細胞取代，但活細胞總數(shù)保持不變。如果你在研究孢子形成細菌，這可能是營養(yǎng)細胞孢子形成或新孢子形成的階段。最后，死亡(或衰退)階段是由多種因素引起的，包括營養(yǎng)或氧氣的缺乏，細胞代謝引起的培養(yǎng)基酸堿度的變化，或有毒細胞廢物的積累。
使用OD600來確定您的文化處于哪個階段。
最簡單的方法是測量OD600或600 nm的光密度，以測量介質(zhì)在其生長曲線上的距離。這個波長是專門為細菌OD測量選擇的，因為與紫外線波長不同，600納米對培養(yǎng)無害。這種波長通常不會被像TSB和LB這樣的黃色介質(zhì)吸收。通過監(jiān)測OD600的生長速度，可以確定培養(yǎng)物的滯后期、記錄期和穩(wěn)定期。
那么如何衡量呢？對于懸浮在液體中的簡單細胞，首先需要零或“空白”分光光度計和新鮮、未接種的培養(yǎng)基減去培養(yǎng)基對測量的任何吸收貢獻。然后，拿起你的文化樣品，測量OD600。這種測量方法可以很容易地計算出燒瓶中每毫升培養(yǎng)細胞的總數(shù)。不錯吧。盡管如此，還是有一些事情需要注意。
當你取培養(yǎng)基樣本時，一定要混合好，并立即測量，因為細胞可能在大約一分鐘內(nèi)開始沉淀，這將導致不準確的結(jié)果。
如果細菌在溶液中形成生物膜或聚集體，將嚴重影響測量的準確性和精度。在這種情況下，您可能需要超聲處理或進一步處理培養(yǎng)物來分解這些“簇”。查閱關(guān)于您用來避免或消除此問題的菌株的文獻。
最重要的是，1的OD值不準確！如此高的OD讀數(shù)超出了大多數(shù)分光光度計的動態(tài)范圍，這意味著這些讀數(shù)不會隨著細胞濃度的增加而線性增加。如果您得到的OD值大于1，將您的樣品稀釋2倍或更多，直到它達到OD600 1。
如果你經(jīng)常在燒瓶中培養(yǎng)細菌，訓練自己用眼睛估計OD值是有幫助的。這樣，當燒瓶明顯超出你要找的OD范圍時，跳過OD600檢查可以節(jié)省寶貴的時間。有關(guān)更多信息，請參見本文，并考慮使用微孔板讀數(shù)器來提高OD測量的吞吐量。
其他監(jiān)測生長和代謝的方法
雖然使用培養(yǎng)物的OD600來監(jiān)測生長是一種成熟且真實的方法，但還有其他幾種方法來評估細菌培養(yǎng)物的生長和代謝。您可能會發(fā)現(xiàn)其中一些因素對您的特定應用更相關(guān)或更有用！
通過收集培養(yǎng)物的樣品并在顯微鏡下檢查，你可以開始知道培養(yǎng)物中活細胞的大致濃度。額外的好處：你可以比較細胞的圖片，看看是否有不同的形態(tài)批次，或者一個孢子形成過程中培養(yǎng)了多少營養(yǎng)細胞。
溶解氧和二氧化碳?？紤]啤酒(由酵母制成)、康普茶(由酵母和各種細菌制成)以及其他由微生物發(fā)酵的飲料。在這些例子中，隨著發(fā)酵的進行，氧氣(O2)被消耗，二氧化碳(CO2)形成。同樣的過程發(fā)生在需氧細菌培養(yǎng)中！溶解氧和CO2探針是生物反應器中常用的探針。如果你想要一個微創(chuàng)的選擇，有光學傳感器(和貼片)，使用LED熒光監(jiān)測從外面溶解2瓶！
大多數(shù)細菌，包括大腸桿菌，會隨著時間的推移降低培養(yǎng)基的酸堿度。對于一些物種來說，酸的產(chǎn)生實際上限制了培養(yǎng)物的最大生長和生存能力。像氧傳感器一樣，有一種方法可以無創(chuàng)地連續(xù)監(jiān)測燒瓶中的酸堿度。
糖的分析。使用一些儀器，可以快速可靠地測定生長培養(yǎng)基中的殘留糖。例如，如果您的培養(yǎng)基中的主要碳源是葡萄糖，那么在細菌生長中間獲取葡萄糖測量數(shù)據(jù)可以讓您知道培養(yǎng)基在生長曲線中的位置。
那么什么時候應該收獲一種文化呢？
簡而言之，這完全取決于文化的最終目標是什么。例如，我培養(yǎng)并誘導了大量大腸桿菌過度表達非天然蛋白質(zhì)，然后從培養(yǎng)物中純化它們。我經(jīng)常發(fā)現(xiàn)我從培養(yǎng)中獲得的蛋白質(zhì)的質(zhì)量和數(shù)量取決于我收獲時的相細胞。然而，在其他情況下，目標只是獲得盡可能多的細胞。
一旦你知道了需要收集的細胞的具體生長階段，一定要進行一些測試(包括測量)，確保你對細菌生長時間的評估是正確的。這將讓你強烈地感覺到你的文化需要多長時間來準備收獲，并提供歷史數(shù)據(jù)來比較增長曲線。總是從一個小的“種子”培養(yǎng)開始，以獲得一個可靠的和不斷增長的燒瓶。最后，如果你不習慣減少污染的風險，你可以多次測試你的細胞培養(yǎng)技術(shù)。
從相對簡單的O
D測量到代謝物分析，有很多方法可以監(jiān)視實驗室中正在生長的細菌。由于生長階段對文化有很大影響，知道如何準確測量這個參數(shù)是任何細菌實驗室的關(guān)鍵技術(shù)!標簽：
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