你在沃爾特和伊萊扎霍爾研究所實(shí)驗(yàn)室的關(guān)鍵領(lǐng)域是什么？
我們是澳大利亞領(lǐng)先的醫(yī)學(xué)研究機(jī)構(gòu)之一。我經(jīng)營(yíng)蛋白質(zhì)集團(tuán)的平臺(tái)技術(shù)實(shí)驗(yàn)室。作為一個(gè)研究機(jī)構(gòu)，我們的大部分研究都集中在癌癥、免疫紊亂和傳染病上。然而，最近，我們的研究重點(diǎn)已經(jīng)發(fā)展到健康發(fā)育和衰老。該研究所有93個(gè)實(shí)驗(yàn)室和1000多名員工，涵蓋各種疾病。員工的數(shù)量意味著我們必須有高吞吐量。有這么多員工，考慮我們的基礎(chǔ)設(shè)施以及如何最大限度地提高產(chǎn)量非常重要。
隨著時(shí)間的推移，實(shí)驗(yàn)室里發(fā)生的一件事是，我們需要檢測(cè)蛋白質(zhì)的形式?？紤]PTM效應(yīng)和其他翻譯后效應(yīng)時(shí)存在的蛋白質(zhì)形式。
我們投入了大量資金來(lái)了解蛋白質(zhì)形式的生理功能，并開發(fā)技術(shù)來(lái)更好地檢測(cè)它們。目前，我們正在使用質(zhì)譜儀，但我們知道我們只是看到了冰山一角。雖然這些儀器非常靈敏，但動(dòng)態(tài)范圍是主要的限制因素，因?yàn)槲覀冎牢覀兎治龅募?xì)胞和許多生物液體中的動(dòng)態(tài)范圍比我們可以檢測(cè)的范圍大得多。
為什么理解PTM的影響很重要？
大多數(shù)醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室使用自下而上的蛋白質(zhì)組學(xué)，通常側(cè)重于以基因?yàn)橹行牡姆绞绞褂玫鞍踪|(zhì)組學(xué)(蛋白質(zhì)堿基定量)。在我們的實(shí)驗(yàn)室中，因?yàn)槲覀兣c許多細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組一起工作，許多與我們合作的蛋白質(zhì)在翻譯后都被修飾了，所以對(duì)我們來(lái)說(shuō)，在不同條件下監(jiān)測(cè)這些PTM變化是非常重要的。我們通常在蛋白質(zhì)的背景下考慮PTM，這種蛋白質(zhì)體現(xiàn)在“蛋白質(zhì)形式”的概念中，我們對(duì)化學(xué)修飾基因產(chǎn)物的功能版本的分子真正感興趣。
在給定的時(shí)間點(diǎn)，我們可以檢測(cè)到任何細(xì)胞中表達(dá)的大約11，000到13，000個(gè)基因產(chǎn)物。翻譯后修飾可以通過(guò)RNA編輯或編碼不同的SNPs、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、截短、蛋白酶切割或化學(xué)修飾如磷酸化來(lái)進(jìn)行。有超過(guò)107種已知的內(nèi)源性翻譯后修飾。這些蛋白質(zhì)樣本的復(fù)雜性可能是天文數(shù)字。話雖如此，我預(yù)計(jì)在任何時(shí)間點(diǎn)，給定細(xì)胞的蛋白質(zhì)形式可能約為1000萬(wàn)。
在我的實(shí)驗(yàn)室里，我們的目標(biāo)是深入研究并盡可能多地關(guān)注這些基于PTM的蛋白質(zhì)形式。如果我們能進(jìn)行非常深入的測(cè)量，我相信我們可以開始將翻譯后修飾的蛋白質(zhì)與一些表型聯(lián)系起來(lái)。這接近于理解為什么我們會(huì)看到表型的差異。
分析蛋白質(zhì)形式的最佳方法是什么？
分析這些蛋白質(zhì)形式和可能的不同蛋白質(zhì)形式的最佳方法之一是分析完整的蛋白質(zhì)。幾年前，當(dāng)我們開發(fā)出一種高通量高效純化蛋白質(zhì)的方法時(shí)，我們致力于這項(xiàng)工作。
我們使用順磁珠作為成核劑來(lái)沉淀我們的蛋白質(zhì)形式。如果您熟悉樹脂基SP3法，可以使用這種方法，但需要額外的洗脫步驟。因此，我們從蛋白質(zhì)聚集領(lǐng)域獲得了一些知識(shí)，并結(jié)合甲酸以非常有效和無(wú)偏見的方式提取和純化蛋白質(zhì)。當(dāng)你這樣做的時(shí)候，你最終會(huì)得到一個(gè)非常健壯和高度可重復(fù)的方法來(lái)釋放完整的蛋白質(zhì)用于質(zhì)譜分析。
來(lái)自液相色譜分離的MS1信號(hào)提供了我們可以在單槍中檢測(cè)到的所有完整蛋白質(zhì)的測(cè)量值。平均而言，一次注射可以檢測(cè)到大約2000種不同形式的蛋白質(zhì)，揭示了令人難以置信的基因產(chǎn)物的異質(zhì)性陣列。
我們發(fā)現(xiàn)，平均而言，蛋白質(zhì)以大約八種不同的形式存在(PTM形式)。因此，當(dāng)使用自下而上的蛋白質(zhì)組學(xué)時(shí)，我們知道我們所尋找的是真正蛋白質(zhì)的冰山一角。我們知道蛋白質(zhì)形式的功能異質(zhì)性比我們目前在這個(gè)領(lǐng)域所知道的要多得多。
如果有更深入研究這一點(diǎn)的方法就太好了！我們知道這只是開始，因?yàn)楫?dāng)你考慮分析完整的蛋白質(zhì)時(shí)，信號(hào)強(qiáng)度通過(guò)同位素和電荷狀態(tài)的分布非常分散，這意味著我們的動(dòng)態(tài)范圍是有限的，而且我們對(duì)深度挖掘的能力有嚴(yán)格的限制，所以我們可以使用這種方法進(jìn)入蛋白質(zhì)地層。
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