利用基于質譜的蛋白質組學研究人類疾病

你在沃爾特和伊萊扎霍爾研究所實驗室的關鍵領域是什么？

我們是澳大利亞領先的醫(yī)學研究機構之一。我經營蛋白質集團的平臺技術實驗室。作為一個研究機構，我們的大部分研究都集中在癌癥、免疫紊亂和傳染病上。然而，最近，我們的研究重點已經發(fā)展到健康發(fā)育和衰老。該研究所有93個實驗室和1000多名員工，涵蓋各種疾病。員工的數量意味著我們必須有高吞吐量。有這么多員工，考慮我們的基礎設施以及如何最大限度地提高產量非常重要。

隨著時間的推移，實驗室里發(fā)生的一件事是，我們需要檢測蛋白質的形式?？紤]PTM效應和其他翻譯后效應時存在的蛋白質形式。

我們投入了大量資金來了解蛋白質形式的生理功能，并開發(fā)技術來更好地檢測它們。目前，我們正在使用質譜儀，但我們知道我們只是看到了冰山一角。雖然這些儀器非常靈敏，但動態(tài)范圍是主要的限制因素，因為我們知道我們分析的細胞和許多生物液體中的動態(tài)范圍比我們可以檢測的范圍大得多。

為什么理解PTM的影響很重要？

大多數醫(yī)學研究實驗室使用自下而上的蛋白質組學，通常側重于以基因為中心的方式使用蛋白質組學(蛋白質堿基定量)。在我們的實驗室中，因為我們與許多細胞信號轉導組一起工作，許多與我們合作的蛋白質在翻譯后都被修飾了，所以對我們來說，在不同條件下監(jiān)測這些PTM變化是非常重要的。我們通常在蛋白質的背景下考慮PTM，這種蛋白質體現在“蛋白質形式”的概念中，我們對化學修飾基因產物的功能版本的分子真正感興趣。

在給定的時間點，我們可以檢測到任何細胞中表達的大約11，000到13，000個基因產物。翻譯后修飾可以通過RNA編輯或編碼不同的SNPs、轉錄調節(jié)、截短、蛋白酶切割或化學修飾如磷酸化來進行。有超過107種已知的內源性翻譯后修飾。這些蛋白質樣本的復雜性可能是天文數字。話雖如此，我預計在任何時間點，給定細胞的蛋白質形式可能約為1000萬。

在我的實驗室里，我們的目標是深入研究并盡可能多地關注這些基于PTM的蛋白質形式。如果我們能進行非常深入的測量，我相信我們可以開始將翻譯后修飾的蛋白質與一些表型聯系起來。這接近于理解為什么我們會看到表型的差異。

分析蛋白質形式的最佳方法是什么？

分析這些蛋白質形式和可能的不同蛋白質形式的最佳方法之一是分析完整的蛋白質。幾年前，當我們開發(fā)出一種高通量高效純化蛋白質的方法時，我們致力于這項工作。

我們使用順磁珠作為成核劑來沉淀我們的蛋白質形式。如果您熟悉樹脂基SP3法，可以使用這種方法，但需要額外的洗脫步驟。因此，我們從蛋白質聚集領域獲得了一些知識，并結合甲酸以非常有效和無偏見的方式提取和純化蛋白質。當你這樣做的時候，你最終會得到一個非常健壯和高度可重復的方法來釋放完整的蛋白質用于質譜分析。

來自液相色譜分離的MS1信號提供了我們可以在單槍中檢測到的所有完整蛋白質的測量值。平均而言，一次注射可以檢測到大約2000種不同形式的蛋白質，揭示了令人難以置信的基因產物的異質性陣列。

我們發(fā)現，平均而言，蛋白質以大約八種不同的形式存在(PTM形式)。因此，當使用自下而上的蛋白質組學時，我們知道我們所尋找的是真正蛋白質的冰山一角。我們知道蛋白質形式的功能異質性比我們目前在這個領域所知道的要多得多。

如果有更深入研究這一點的方法就太好了！我們知道這只是開始，因為當你考慮分析完整的蛋白質時，信號強度通過同位素和電荷狀態(tài)的分布非常分散，這意味著我們的動態(tài)范圍是有限的，而且我們對深度挖掘的能力有嚴格的限制，所以我們可以使用這種方法進入蛋白質地層。

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