當(dāng)AlexRosenberg博士和CharlieRoco博士還是華盛頓大學(xué)GeorgSeelig實驗室的研究生時，他們在白板上提出了如何提高單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)可擴展性的想法。當(dāng)時，大約五年前，“大規(guī)模約為100個細(xì)胞，”羅森伯格說。他們將自己的想法發(fā)展為基于分割池連接的轉(zhuǎn)錄組測序(SPLiT-seq)的技術(shù)。
Rosenberg表示，2018年概念驗證論文在《科學(xué)》雜志上發(fā)表后，電子郵件就開始滾滾而來。他說，“大量”團體主動聯(lián)系，詢問如何在自己的系統(tǒng)中設(shè)置SPLiT-seq實驗室。兩名學(xué)生一獲得博士學(xué)位，就抓住了這個機會，創(chuàng)辦了一家名為SplitBiosciences(最近更名為ParseBiosciences)的公司，將該技術(shù)商業(yè)化。
ParseBiosciences的研究人員。
上周，在美國人類遺傳學(xué)學(xué)會(ASHG)年度會議上，ParseBio團隊發(fā)布了一款配有數(shù)據(jù)分析軟件的新試劑盒。該產(chǎn)品允許任何研究人員使用單細(xì)胞懸浮液并進(jìn)行DNA測序，對多達(dá)100萬個細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq。
更好的捕鼠器
就在Rosenberg和Roco發(fā)表SPLiT-seq論文的三年前，來自波士頓的兩個研究小組——一個來自布羅德研究所，由EvanMacosko博士領(lǐng)導(dǎo)，另一個來自哈佛醫(yī)學(xué)院，由MarcKirschner博士領(lǐng)導(dǎo)——連續(xù)發(fā)表了《細(xì)胞》雜志上的論文描述了基于微流體的方法來分離液滴中的單個細(xì)胞。第二年，10XGenomics推出了基于這些技術(shù)的Chromium系統(tǒng)。從那時起，10XGenomics已成為該領(lǐng)域的既定領(lǐng)導(dǎo)者，并幫助發(fā)起了scRNA-seq革命。
但羅森伯格認(rèn)為還有改進(jìn)的空間，并且ParseBio的試劑盒比當(dāng)今現(xiàn)有的技術(shù)更好。他說，由于SPLiT-seq的簡單性，它缺乏基于液滴的方法中的一些限制。一個例子是，細(xì)胞的大小在SPLiT-seq中并不重要。這一優(yōu)勢以及其他優(yōu)勢使得scRNA-seq更易于使用且更容易擴大規(guī)模。
細(xì)胞是隔室
單細(xì)胞正是如此，基于微流體的系統(tǒng)促進(jìn)了細(xì)胞的物理分離。每個細(xì)胞都位于其自己的單獨隔室中，可以用特定于其部分的條形碼單獨標(biāo)記。
但SPLiT-seq的工作原理不同——細(xì)胞之間并不是物理隔離的。細(xì)胞是隔室。為此，細(xì)胞被固定然后透化。生化試劑進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，并添加條形碼。使用組合條形碼，該方法可以標(biāo)記大量細(xì)胞。
理論上，無需額外的臺式機器，任何分子生物學(xué)實驗室都可以使用SPLiT-seq進(jìn)行scRNA-seq實驗。使用完試劑盒后，即可制備出可在任何測序儀上進(jìn)行測序的文庫。然后使用套件中包含的軟件分析數(shù)據(jù)。
ParseBio自今年2月起推出了一款試劑盒(EvercodeWholeTranscriptomeKit)，可以對100,000個細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq。上周，在ASHG上，該公司推出了可進(jìn)行一百萬個細(xì)胞的EvercodeMega，以及用于小型實驗的EvercodeMini。
一切都與概率有關(guān)
SPLiT-seq如何解析出一百萬個細(xì)胞?Rosenberg是這樣解釋的：如果你從100萬個細(xì)胞開始，將它們分成96個孔，每個孔大約有10,000個細(xì)胞。一個孔中的每個細(xì)胞都有一個條形碼。那是10,000個帶有一個條形碼的細(xì)胞——不完全是一個唯一的標(biāo)簽。然后，將細(xì)胞匯集在一起??并再次隨機分配到具有96個新孔的第二個板中。當(dāng)每個細(xì)胞開始采取獨特的路徑通過這些孔時，每個孔中都會添加第二個條形碼。這個過程通過第三輪和第四輪再次完成。隨著協(xié)議的進(jìn)展，任何兩個細(xì)胞獲得相同條形碼組合的概率變得越來越小。
然而，兩個細(xì)胞有可能一起穿過所有四輪，形成雙聯(lián)體。在其他基于液滴的技術(shù)中，兩個細(xì)胞也有可能最終出現(xiàn)在同一個液滴中。當(dāng)嘗試使用液滴擴大規(guī)模時，隨著放入更多的細(xì)胞，雙聯(lián)體的可能性會增加。
鑒于組合條形碼的指數(shù)性質(zhì)，SPLiT-seq產(chǎn)生的雙聯(lián)體數(shù)量較少。可以使用涉及小鼠細(xì)胞和人類細(xì)胞混合的標(biāo)準(zhǔn)方法來測量雙聯(lián)體。使用該技術(shù)，在100萬個細(xì)胞中，ParseBio試劑盒觀察到的雙聯(lián)體率為3.2%。真正的雙峰率是其兩倍。
戰(zhàn)利品歸勝利者所有
與任何打入已經(jīng)成熟市場的技術(shù)一樣，SPLiT-seq需要克服市場障礙有一條艱難的道路。在過去五年中，scRNA-seq呈爆炸式增長，這主要歸功于10XGenomicsChromium，它在全國各地的核心基因組學(xué)設(shè)施中啟動并運行。西海岸一家學(xué)術(shù)機構(gòu)的一位研究人員告訴GEN，他們的實驗室已經(jīng)開始使用Chromium生成一個大地圖集，現(xiàn)在不打算改變。
任何一家DNA測序公司都可以證明，開發(fā)新基因組技術(shù)的游戲并不是那些厭倦競爭的人所玩的游戲。但當(dāng)Rosenberg告訴GENParse的產(chǎn)品“幾乎在每個軸上都比競爭對手更好”時，他明確表示他已準(zhǔn)備好離開替補席。
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