2021年8 月 23 日——一種新的 CRISPR 基因編輯篩選方法可用于將動物模型中的表型和基因型聯(lián)系起來。根據(jù)8 月 19 日發(fā)表在《科學》雜志上的一篇論文，該方法在斑馬魚中得到了有效部署，并顯著減少了評估數(shù)百個基因功能所需的時間。
正向遺傳學是一種用于確定導致表型的遺傳基礎(chǔ)的分子遺傳學方法，需要大量時間和勞動力。這種方法需要創(chuàng)建模式生物，例如斑馬魚——它們與人類共享大部分基因——顯示正在研究的特征。育種后，分離出具有所需表型的突變體并鑒定基因。
反向遺傳學方法有可能緩解正向遺傳學的一些問題，但在過去，它們受到嚴重受限的吞吐量能力的阻礙。在反向遺傳學中，可以通過分析細胞表型來確定基因序列的影響。通過選擇性地修改基因，研究人員可以在整個生物體中尋找影響。
CRISPR 技術(shù)已廣泛用于反向遺傳方法。然而，通常使用引導 RNA (gRNA) 一次完成一個目標基因，然后將 Cas9-gRNA 核糖核蛋白復合物注射到動物模型中。這導致單個基因的關(guān)閉。如果研究人員想要針對不同的基因，他們需要設(shè)計額外的 gRNA 并將其注入不同的生物體。
猶他大學健康學院藥學院院長蘭德爾·彼得森博士在一份聲明中說：“這個過程一直集中在單個基因或一次修改上。” “所以，如果你想做 100 個基因，它的工作量是其 100 倍。”
猶他大學健康大學的研究人員開發(fā)了一種稱為多重混合 CRISPR 液滴 (MIC-Drop) 的平臺，用于在斑馬魚中進行大規(guī)模反向遺傳篩選。
研究人員從解決特定科學問題的目標 gRNA 庫開始。該平臺使用微流體技術(shù)生成納升大小的液滴。每個液滴都包含靶向目標基因的 Cas9 多重 gRNA 和與每個目標基因相關(guān)的條形碼。這些液滴混合在一起以累積靶向數(shù)百到數(shù)千個不同的基因。
該團隊用一根針將混合的液滴注射到斑馬魚胚胎中。培育了數(shù)百個斑馬魚胚胎;那些表現(xiàn)出感興趣的表型的被分離出來，并通過測序條形碼揭示了擾動基因的身份。
Herron 提供。
博士后研究員 Saba Parvez 博士解釋說，以前，在斑馬魚中設(shè)置數(shù)百個基因的 CRISPR 篩選需要一個研究小組花費數(shù)天時間，并且需要數(shù)百根針，他開發(fā)并優(yōu)化了 MIC-Drop 的包裝技術(shù)和條形碼系統(tǒng)。
“現(xiàn)在，您已將該流程簡化為一個用戶在幾個小時內(nèi)完成，”Parvez 說。
為了測試 MIC-Drop 是否可以識別導致特定表型的基因，研究人員將含有靶向 tyr(酪氨酸酶)或 npas41(神經(jīng)元 PAS 域蛋白 2)基因的 gRNA 的液滴加入含有其他 gRNA 的液滴中，占總數(shù)的 2% . tyr 基因與白化病相關(guān)，npas41 基因與 cloche 表型(有缺陷的心臟結(jié)構(gòu))相關(guān)。
數(shù)百個胚胎被注射了混合液滴，并記錄了白化和鐘形表型的頻率。研究人員分別觀察到 1.7% 的白化和 2.2% 的 cloche 表型頻率，這與預期頻率相匹配。
科學家們還使用該平臺來識別 optivin 的靶標，optivin 是瞬時受體電位陽離子通道亞家族 A 成員 1b (trpa1b )的小分子激動劑。實驗表明 trpa1b 基因型是斑馬魚胚胎疾病表型的主要原因。
最后，為了測試 MIC-Drop 是否可以識別對心臟發(fā)育或功能的特定方面有貢獻的基因，研究人員評估了 188 個在心臟發(fā)育中具有潛在作用的基因。在創(chuàng)建針對所有 188 個基因的 gRNA 并將它們引入胚胎后，發(fā)現(xiàn)了發(fā)生心臟缺陷的魚。
DNA 條形碼用于識別具有形態(tài)表型的 13 個新基因，這些基因丟失后會導致各種特定的心臟或血液表型，例如卟啉癥(血紅素障礙)、心律失常和心臟發(fā)育異常。
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