2021年8 月 23 日——一種新的 CRISPR 基因編輯篩選方法可用于將動(dòng)物模型中的表型和基因型聯(lián)系起來(lái)。根據(jù)8 月 19 日發(fā)表在《科學(xué)》雜志上的一篇論文，該方法在斑馬魚中得到了有效部署，并顯著減少了評(píng)估數(shù)百個(gè)基因功能所需的時(shí)間。
正向遺傳學(xué)是一種用于確定導(dǎo)致表型的遺傳基礎(chǔ)的分子遺傳學(xué)方法，需要大量時(shí)間和勞動(dòng)力。這種方法需要?jiǎng)?chuàng)建模式生物，例如斑馬魚——它們與人類共享大部分基因——顯示正在研究的特征。育種后，分離出具有所需表型的突變體并鑒定基因。
反向遺傳學(xué)方法有可能緩解正向遺傳學(xué)的一些問(wèn)題，但在過(guò)去，它們受到嚴(yán)重受限的吞吐量能力的阻礙。在反向遺傳學(xué)中，可以通過(guò)分析細(xì)胞表型來(lái)確定基因序列的影響。通過(guò)選擇性地修改基因，研究人員可以在整個(gè)生物體中尋找影響。
CRISPR 技術(shù)已廣泛用于反向遺傳方法。然而，通常使用引導(dǎo) RNA (gRNA) 一次完成一個(gè)目標(biāo)基因，然后將 Cas9-gRNA 核糖核蛋白復(fù)合物注射到動(dòng)物模型中。這導(dǎo)致單個(gè)基因的關(guān)閉。如果研究人員想要針對(duì)不同的基因，他們需要設(shè)計(jì)額外的 gRNA 并將其注入不同的生物體。
猶他大學(xué)健康學(xué)院藥學(xué)院院長(zhǎng)蘭德?tīng)?middot;彼得森博士在一份聲明中說(shuō)：“這個(gè)過(guò)程一直集中在單個(gè)基因或一次修改上。” “所以，如果你想做 100 個(gè)基因，它的工作量是其 100 倍。”
猶他大學(xué)健康大學(xué)的研究人員開(kāi)發(fā)了一種稱為多重混合 CRISPR 液滴 (MIC-Drop) 的平臺(tái)，用于在斑馬魚中進(jìn)行大規(guī)模反向遺傳篩選。
研究人員從解決特定科學(xué)問(wèn)題的目標(biāo) gRNA 庫(kù)開(kāi)始。該平臺(tái)使用微流體技術(shù)生成納升大小的液滴。每個(gè)液滴都包含靶向目標(biāo)基因的 Cas9 多重 gRNA 和與每個(gè)目標(biāo)基因相關(guān)的條形碼。這些液滴混合在一起以累積靶向數(shù)百到數(shù)千個(gè)不同的基因。
該團(tuán)隊(duì)用一根針將混合的液滴注射到斑馬魚胚胎中。培育了數(shù)百個(gè)斑馬魚胚胎;那些表現(xiàn)出感興趣的表型的被分離出來(lái)，并通過(guò)測(cè)序條形碼揭示了擾動(dòng)基因的身份。
Herron 提供。
博士后研究員 Saba Parvez 博士解釋說(shuō)，以前，在斑馬魚中設(shè)置數(shù)百個(gè)基因的 CRISPR 篩選需要一個(gè)研究小組花費(fèi)數(shù)天時(shí)間，并且需要數(shù)百根針，他開(kāi)發(fā)并優(yōu)化了 MIC-Drop 的包裝技術(shù)和條形碼系統(tǒng)。
“現(xiàn)在，您已將該流程簡(jiǎn)化為一個(gè)用戶在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)完成，”Parvez 說(shuō)。
為了測(cè)試 MIC-Drop 是否可以識(shí)別導(dǎo)致特定表型的基因，研究人員將含有靶向 tyr(酪氨酸酶)或 npas41(神經(jīng)元 PAS 域蛋白 2)基因的 gRNA 的液滴加入含有其他 gRNA 的液滴中，占總數(shù)的 2% . tyr 基因與白化病相關(guān)，npas41 基因與 cloche 表型(有缺陷的心臟結(jié)構(gòu))相關(guān)。
數(shù)百個(gè)胚胎被注射了混合液滴，并記錄了白化和鐘形表型的頻率。研究人員分別觀察到 1.7% 的白化和 2.2% 的 cloche 表型頻率，這與預(yù)期頻率相匹配。
科學(xué)家們還使用該平臺(tái)來(lái)識(shí)別 optivin 的靶標(biāo)，optivin 是瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道亞家族 A 成員 1b (trpa1b )的小分子激動(dòng)劑。實(shí)驗(yàn)表明 trpa1b 基因型是斑馬魚胚胎疾病表型的主要原因。
最后，為了測(cè)試 MIC-Drop 是否可以識(shí)別對(duì)心臟發(fā)育或功能的特定方面有貢獻(xiàn)的基因，研究人員評(píng)估了 188 個(gè)在心臟發(fā)育中具有潛在作用的基因。在創(chuàng)建針對(duì)所有 188 個(gè)基因的 gRNA 并將它們引入胚胎后，發(fā)現(xiàn)了發(fā)生心臟缺陷的魚。
DNA 條形碼用于識(shí)別具有形態(tài)表型的 13 個(gè)新基因，這些基因丟失后會(huì)導(dǎo)致各種特定的心臟或血液表型，例如卟啉癥(血紅素障礙)、心律失常和心臟發(fā)育異常。
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