光——以及所有波——可以繞過(guò)沿其路徑發(fā)現(xiàn)的障礙物的角落。由于這種稱為衍射的現(xiàn)象，不可能將光聚焦到小于其波長(zhǎng)一半的光點(diǎn)上。換句話說(shuō)，理論上使用光學(xué)顯微鏡可以達(dá)到的最高分辨率約為 250 nm，這是一個(gè)稱為衍射極限的障礙。不幸的是，這種分辨率不足以觀察精細(xì)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，例如在神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。
一個(gè)多世紀(jì)以來(lái)，在超分辨率熒光顯微鏡發(fā)明之前，顯微鏡學(xué)家一直被這一經(jīng)典障礙所束縛。1990 年代后期開(kāi)發(fā)了一種特別強(qiáng)大的方法，并創(chuàng)造了受激發(fā)射損耗 (STED) 顯微鏡。這種技術(shù)要求目標(biāo)樣品含有熒光團(tuán)，熒光團(tuán)是一種在一個(gè)波長(zhǎng)處吸收光然后在更長(zhǎng)的波長(zhǎng)處重新發(fā)射的化合物。在 STED 顯微鏡的最簡(jiǎn)單版本中，通過(guò)衍射極限聚焦激光的照射，熒光團(tuán)在圓形光斑中被激發(fā)。然后，用能量較低的光(耗盡光束)照射光斑周圍的甜甜圈形部分，通過(guò)受激發(fā)射過(guò)程關(guān)閉熒光。因此，凈效應(yīng)是只有甜甜圈中心的熒光團(tuán)重新發(fā)射光子，
盡管 STED 顯微鏡是在更高分辨率下觀察活神經(jīng)元形態(tài)的真正突破，但仍有改進(jìn)的空間。在最近發(fā)表在Neurophotonics 上的一項(xiàng)研究中，由波爾多大學(xué)的 U. Valentin Nägerl 博士領(lǐng)導(dǎo)的一組科學(xué)家開(kāi)發(fā)了一種簡(jiǎn)單而有效的校準(zhǔn)方法，可以在更高的組織深度進(jìn)行更精確的 STED 成像。他們的方法基于分析和校正生物樣品 STED 顯微鏡系統(tǒng)誤差的主要來(lái)源之一：耗盡光束的球面像差。
當(dāng)在高于 40 μm 的深度對(duì)組織樣本進(jìn)行成像時(shí)，耗盡光束會(huì)遭受各種類型的散焦和退化(像差)并失去其精心設(shè)計(jì)的形狀，這對(duì)于 STED 方法至關(guān)重要。球面像差是最大的問(wèn)題，也是研究人員的目標(biāo)。他們的策略是首先準(zhǔn)備一個(gè)腦組織模型樣本，這是一種基于凝膠的代理，其折射率與實(shí)際大腦的折射率相似。這個(gè)體模樣本包含均勻分散的熒光團(tuán)和金納米粒子，這使團(tuán)隊(duì)能夠清楚地可視化和量化耗盡光束的形狀在穿透更深時(shí)如何變形。然后，他們根據(jù)組織深度計(jì)算了應(yīng)該對(duì)耗盡光束進(jìn)行的必要預(yù)調(diào)整，使其最終形狀更接近理想形狀。
一旦根據(jù)體模測(cè)試校準(zhǔn)了耗盡光束的形狀，科學(xué)家們就開(kāi)始對(duì)活體神經(jīng)組織進(jìn)行成像。他們比較了常規(guī) STED 顯微鏡、校正 STED 顯微鏡和雙光子顯微鏡(一種專門針對(duì)深層組織成像進(jìn)行調(diào)整的技術(shù))的結(jié)果。結(jié)果非常令人信服：校正后的 STED 圖像比標(biāo)準(zhǔn) STED 圖像更能捕捉到更深神經(jīng)樹(shù)突的精細(xì)細(xì)節(jié)。“使用我們的校準(zhǔn)策略，我們可以在生物組織內(nèi)部 90 μm 的深度測(cè)量小至 80 nm 的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，并在校正球面像差后獲得 60% 的信號(hào)增加，”Nägerl 說(shuō)。
約翰霍普金斯大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程教授姬毅評(píng)論說(shuō)：“超分辨率顯微鏡主要應(yīng)用于薄樣品，例如單層細(xì)胞，光散射可以忽略不計(jì)。由 Valentin Nägerl 領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)在兩個(gè)- 光子受激發(fā)射損耗顯微鏡 (2P-STED)，通過(guò) 90 微米腦組織實(shí)現(xiàn)了 80nm 成像神經(jīng)元樹(shù)突棘的分辨率。這是值得注意的，因?yàn)樵谳^厚的組織中很難保持超分辨率——特別是考慮到高散射質(zhì)量腦組織。”Yi解釋說(shuō)，這一進(jìn)步將促進(jìn)對(duì)神經(jīng)活動(dòng)和相互作用的研究。
考慮到這種新穎的校準(zhǔn)過(guò)程穩(wěn)健、易于實(shí)施且相對(duì)便宜，它可以很容易地融入標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室實(shí)踐中，以便使用 STED 顯微鏡獲得更好的結(jié)果，只要制備的體模樣品與生物標(biāo)本的光學(xué)特性相匹配。在這方面，Nägerl 表示：“我們的方法不僅限于大腦樣本;它可以適用于具有已知且相對(duì)均勻的折射率的其他組織，以及其他類型的制劑，甚至可能適用于完整的活小鼠大腦。 ”
標(biāo)簽： 腦成像
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